Перед началом протокола выделения нуклеиновых кислот для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 рекомендуем все образцы встряхивать на вортексе в течение 5-6 секунд при максимально возможной скорости. Это поможет получить более однородный материал для проведения ПЦР диагностики, предотвратит расслоение образцов. При работе с мокротой рекомендуем использовать транспортную среду с муколитиком или добавлять в образец Муколизин.
При большом количестве образцов в лаборатории рекомендуется полный объем магнитного сорбента вносить прямо в лизирующий буфер, поставляемый в заводском флаконе от производителя. Закрываем флакон, переворачиваем крышкой вниз и встряхиваем в течение 1 минуты до получения однородного раствора оранжево-коричневого цвета. Приготовленный раствор проверяем на просвет на отсутствие комков неразбитого магнитного сорбента. Данный раствор готов к применению и стабилен при хранении в течение 48 часов при температуре 2-8оС. НЕ РЕКОМЕНДУЕТСЯ вносить по отдельности в каждую пробирку магнитный сорбент, а затем отдельно лизирующий буфер и смешивать компоненты отдельно в каждой пробирке, таким образом вы увеличиваете ошибку дозирования, расходуете больше время на контроль гомогенности полученного раствора, ухудшается степень разбивания магнитных частиц.
В нашей инструкции имеются указания о том, что после внесения образцов в лизирующий буфер предварительно смешанный с магнитными частицами требуется провести инкубацию в течение 10 минут при 60оС (п. 9.1.7). В случае если у вас емкость твердотельного термостата менее 96 образцов, вы можете оставить образцы с лизирующим буфером и магнитным сорбентом на рабочей поверхности при комнатной температуре и поставить их в блок термостата после того, как первая партия образцов проинкубируется.
Отнеситесь внимательно к пункту 9.1.15 инструкции, а именно: «Убедиться, что буфер ALPREP промывочный №2 удален полностью и инкубировать пробирки с открытыми крышками в термостате при 60°С в течение 4-10 мин». Инкубация в данном протоколе проводится для полного высушивания остаточной надосадочной жидкости, т.к. в ней находятся ингибиторы ПЦР, однако и пересушивать магнитные частицы не рекомендуется. Тогда возникает вопрос как мне правильно подобрать время инкубации, поставить 4 минуты или 10 минут. У различных пользователей в зависимости от индивидуальных особенностей и опыта работы остается различное количество остаточной надосадочной жидкости, поэтому мы рекомендуем первоначально поставить время инкубации 4 минуты. Далее извлекаем пару пробирок и просматриваем пробирки есть жидкость внизу или нет. Если жидкость отсутствует переходим к пункту инструкции 9.1.16 и вносим элюирующий буфер. Если жидкость надосадочная не высохла до конца в пробирках, продолжаем далее инкубацию до ее полного высыхания. В случае если из пробирок в термостате издается характерное потрескивание, извлекайте срочно пробирки из термостата и добавляйте элюирующий раствор, ваши магнитные частицы с прикрепленными к ним РНК/ДНК начинают пересыхать.
Часто задаваемые вопросы по пункту 9.1.15
Можно ли увеличить температуру и сократить время инкубации на данном этапе?
Нельзя ни в коем случае повышать температуру инкубации, такие действия приведут к пересыханию магнитных частиц и в конечном счеты вы потратите сэкономленное время на разбивание присохшего (спекшегося) осадка. Время можно сократить при постоянной проверке образцов на полное высыхание надосадочной жидкости.
Что будет если я не досушу надосадочную жидкость?
Если образцы будут использованы для постановки амплификации сразу после проведения выделения скорее всего вы получите выход продуктов и прохождение внутреннего контроля на 5 циклов позднее ожидаемого результата. В случае если такие образцы пойдут на длительное хранение скорее всего РНК в образцах во время хранения разрушиться и вы не получите ни достоверных данных, ни прохождения внутренних контролей. Пожалуйста, следуйте указаниям в инструкции и тогда вы получите достоверные данные и не потратите время на повторные процедуры выделения и амплификации.
Кратковременное центрифугирование
В различных лабораториях установлены разные модели центрифуг под кратковременным центрифугированием понимается разовое нажатие и удержание в течение 3-5 секунд кнопки (Run / Start / Запуск).
Кратковременное встряхивание
В различных лабораториях установлены разные модели вортексов под кратковременным встряхиваем понимается разовое нажатие и удержание в течение 3-5 секунд пробирки или пробирок с образцами.
Осадок
При отборе надосадочной жидкости на всех этапах протокола не задевайте осадок магнитных частиц, старайтесь направлять наконечник дозатора в противоположную сторону от осадка.
Температура
Рекомендуем работать со свежими образцами, при невозможности, хранить образцы в замороженном состоянии при температуре не более минус 16 оС.