Правильное следование инструкциям по работе с набором "ALPREP"

рекомендации по работе

  • Пе­ред на­ча­лом про­то­ко­ла вы­де­ле­ния нук­ле­и­но­вых кис­лот для выяв­ле­ния РНК ко­ро­на­ви­ру­са SARS-CoV-2 ре­ко­мен­ду­ем все об­раз­цы встря­хи­вать на вор­тек­се в те­че­ние 5-6 се­кунд при мак­си­маль­но воз­мож­ной ско­ро­сти. Это по­мо­жет по­лу­чить бо­лее од­но­род­ный ма­те­ри­ал для про­ве­де­ния ПЦР ди­а­гно­сти­ки, предот­вра­тит рас­сло­е­ние об­раз­цов. При ра­бо­те с мокро­той ре­ко­мен­ду­ем ис­поль­зо­вать транс­порт­ную сре­ду с му­ко­ли­ти­ком или до­бав­лять в  об­ра­зец Му­ко­ли­зин.
  • При боль­шом ко­ли­че­стве об­раз­цов в ла­бо­ра­то­рии ре­ко­мен­ду­ет­ся пол­ный объем маг­нит­но­го сор­бен­та вно­сить пря­мо в ли­зи­ру­ю­щий бу­фер, по­став­ля­е­мый в за­вод­ском фла­ко­не от про­из­во­ди­те­ля. За­кры­ва­ем фла­кон, пе­ре­во­ра­чи­ва­ем крыш­кой вниз и встря­хи­ва­ем в те­че­ние 1 ми­ну­ты до по­лу­че­ния од­но­род­но­го рас­тво­ра оран­же­во-ко­рич­не­во­го цве­та. При­го­тов­лен­ный рас­твор про­ве­ря­ем на про­свет на от­сут­ствие ком­ков не­раз­би­то­го маг­нит­но­го сор­бен­та. Дан­ный рас­твор го­тов к при­ме­не­нию и ста­би­лен при хра­не­нии в те­че­ние 48 ча­сов при тем­пе­ра­ту­ре 2-8оС. НЕ РЕ­КО­МЕН­ДУ­ЕТ­СЯ  вно­сить по от­дель­но­сти в каж­дую про­бир­ку маг­нит­ный сор­бент, а за­тем от­дель­но ли­зи­ру­ю­щий бу­фер и сме­ши­вать ком­по­нен­ты от­дель­но в каж­дой про­бир­ке, та­ким об­ра­зом вы уве­ли­чи­ва­е­те ошиб­ку до­зи­ро­ва­ния, рас­хо­ду­е­те боль­ше вре­мя на кон­троль го­мо­ген­но­сти по­лу­чен­но­го рас­тво­ра, ухуд­ша­ет­ся сте­пень раз­би­ва­ния маг­нит­ных ча­стиц.
  • В на­шей ин­струк­ции име­ют­ся ука­за­ния о том, что по­сле вне­се­ния об­раз­цов в ли­зи­ру­ю­щий бу­фер пред­ва­ри­тель­но сме­шан­ный с маг­нит­ны­ми ча­сти­ца­ми тре­бу­ет­ся про­ве­сти ин­ку­ба­цию в те­че­ние 10 ми­нут при 60оС (п. 9.1.7). В слу­чае ес­ли у вас ем­кость твер­до­тель­но­го тер­мо­ста­та ме­нее 96 об­раз­цов, вы мо­же­те оста­вить об­раз­цы с ли­зи­ру­ю­щим бу­фе­ром и маг­нит­ным сор­бен­том на ра­бо­чей по­верх­но­сти при ком­нат­ной тем­пе­ра­ту­ре и по­ста­вить их в блок тер­мо­ста­та по­сле то­го, как пер­вая пар­тия об­раз­цов про­ин­ку­би­ру­ет­ся.
  • От­не­си­тесь вни­ма­тель­но к пунк­ту 9.1.15 ин­струк­ции, а имен­но: «Убе­дить­ся, что бу­фер ALPREP про­мывоч­ный №2 уда­лен пол­но­стью и ин­ку­би­ро­вать про­бир­ки с от­крыты­ми крыш­ка­ми в тер­мо­ста­те при 60°С в те­че­ние 4-10 мин». Ин­ку­ба­ция в дан­ном про­то­ко­ле про­во­дит­ся для пол­но­го вы­су­ши­ва­ния оста­точ­ной на­до­са­доч­ной жид­ко­сти, т.к. в ней на­хо­дят­ся ин­ги­би­то­ры ПЦР, од­на­ко и пе­ре­су­ши­вать маг­нит­ные ча­сти­цы не ре­ко­мен­ду­ет­ся. То­г­да воз­ни­ка­ет во­прос как мне пра­виль­но по­до­брать вре­мя ин­ку­ба­ции, по­ста­вить 4  ми­ну­ты или 10 ми­нут. У раз­лич­ных поль­зо­ва­те­лей в за­ви­си­мо­сти от ин­ди­ви­ду­аль­ных  осо­бен­но­стей и опыта ра­бо­ты оста­ет­ся раз­лич­ное ко­ли­че­ство оста­точ­ной на­до­са­доч­ной жид­ко­сти, по­это­му мы ре­ко­мен­ду­ем пер­во­на­чаль­но по­ста­вить вре­мя ин­ку­ба­ции 4 ми­ну­ты. Да­лее из­вле­ка­ем па­ру про­би­рок и про­смат­ри­ва­ем про­бир­ки есть жид­кость вни­зу или нет. Ес­ли жид­кость от­сут­ству­ет пе­ре­хо­дим к пунк­ту ин­струк­ции 9.1.16 и вно­сим элю­и­ру­ю­щий бу­фер. Ес­ли жид­кость на­до­са­доч­ная не вы­сох­ла до кон­ца в про­бир­ках, про­дол­жа­ем да­лее ин­ку­ба­цию до ее пол­но­го вы­сы­ха­ния.  В слу­чае ес­ли из про­би­рок в тер­мо­ста­те из­да­ет­ся ха­рак­тер­ное по­трес­ки­ва­ние, из­вле­кай­те сроч­но про­бир­ки из тер­мо­ста­та и до­бав­ляй­те элю­и­ру­ю­щий рас­твор, ва­ши маг­нит­ные ча­сти­цы с при­креп­лен­ны­ми к ним РНК/ДНК на­чи­на­ют пе­ре­сы­хать.

Часто задаваемый вопросы по пункту 9.1.15

Нельзя ни в коем случае повышать температуру инкубации, такие действия приведут к пересыханию магнитных  частиц и в конечном счеты вы потратите сэкономленное время на разбивание присохшего (спекшегося) осадка.  Время можно сократить при постоянной проверке образцов на полное высыхание надосадочной жидкости.

Если образцы будут использованы для постановки амплификации сразу после проведения выделения скорее всего вы получите выход продуктов и прохождение внутреннего контроля на 5  циклов позднее ожидаемого результата. В случае если такие образцы пойдут на длительное  хранение скорее всего РНК в образцах во время хранения разрушиться и вы не получите ни достоверных  данных,  ни прохождения внутренних  контролей.  Пожалуйста, следуйте указаниям в инструкции и тогда вы получите достоверные данные и не потратите  время на повторные процедуры выделения и амплификации.

Кратковременное центрифугирование

В различных лабораториях установлены разные модели центрифуг под кратковременным центрифугированием понимается  разовое нажатие и удержание в течение 3-5 секунд кнопки (Run / Start / Запуск)

biosan msc 3000
Biosan msc 3000

Кратковременное встряхивание

В различных лабораториях установлены разные модели вортексов под кратковременным встряхиваем понимается  разовое нажатие и удержание в течение 3-5 секунд пробирки или пробирок с образцами.

Осадок

При отборе надосадочной жидкости на всех этапах протокола не задевайте осадок магнитных частиц, старайтесь направлять наконечник дозатора в противоположную сторону от осадка.

Температура

Рекомендуем работать со свежими образцами, при невозможности, хранить образцы в замороженном состоянии при температуре не более минус 16 оС.