Пра­виль­ное сле­до­ва­ние инструк­циям по работе с набо­ром «ALPREP»

рекомендации по работе

  1. Перед нача­лом про­то­кола выде­ле­ния нук­ле­и­но­вых кис­лот для выяв­ле­ния РНК коро­на­ви­руса SARS-CoV‑2 реко­мен­дуем все образцы встря­хи­вать на вор­тексе в тече­ние 5–6 секунд при мак­си­мально воз­мож­ной ско­ро­сти. Это помо­жет полу­чить более одно­род­ный мате­риал для про­ве­де­ния ПЦР диа­гно­стики, предот­вра­тит рас­сло­е­ние образ­цов. При работе с мок­ро­той реко­мен­дуем исполь­зо­вать транс­порт­ную среду с муко­ли­ти­ком или добав­лять в  обра­зец Муко­ли­зин.
  2. При боль­шом коли­че­стве образ­цов в лабо­ра­то­рии реко­мен­ду­ется пол­ный объем маг­нит­ного сор­бента вно­сить прямо в лизи­ру­ю­щий буфер, постав­ля­е­мый в завод­ском фла­коне от про­из­во­ди­теля. Закры­ваем фла­кон, пере­во­ра­чи­ваем крыш­кой вниз и встря­хи­ваем в тече­ние 1 минуты до полу­че­ния одно­род­ного рас­твора оран­жево-корич­не­вого цвета. При­го­тов­лен­ный рас­твор про­ве­ряем на про­свет на отсут­ствие ком­ков нераз­би­того маг­нит­ного сор­бента. Дан­ный рас­твор готов к при­ме­не­нию и ста­би­лен при хра­не­нии в тече­ние 48 часов при тем­пе­ра­туре 2–8оС. НЕ РЕКО­МЕН­ДУ­ЕТСЯ  вно­сить по отдель­но­сти в каж­дую про­бирку маг­нит­ный сор­бент, а затем отдельно лизи­ру­ю­щий буфер и сме­ши­вать ком­по­ненты отдельно в каж­дой про­бирке, таким обра­зом вы уве­ли­чи­ва­ете ошибку дози­ро­ва­ния, рас­хо­ду­ете больше время на кон­троль гомо­ген­но­сти полу­чен­ного рас­твора, ухуд­ша­ется сте­пень раз­би­ва­ния маг­нит­ных частиц.
  3. В нашей инструк­ции име­ются ука­за­ния о том, что после вне­се­ния образ­цов в лизи­ру­ю­щий буфер пред­ва­ри­тельно сме­шан­ный с маг­нит­ными части­цами тре­бу­ется про­ве­сти инку­ба­цию в тече­ние 10 минут при 60оС (п. 9.1.7). В слу­чае если у вас емкость твер­до­тель­ного тер­мо­стата менее 96 образ­цов, вы можете оста­вить образцы с лизи­ру­ю­щим буфе­ром и маг­нит­ным сор­бен­том на рабо­чей поверх­но­сти при ком­нат­ной тем­пе­ра­туре и поста­вить их в блок тер­мо­стата после того, как пер­вая пар­тия образ­цов про­ин­ку­би­ру­ется.
  4. Отне­си­тесь вни­ма­тельно к пункту 9.1.15 инструк­ции, а именно: «Убе­диться, что буфер ALPREP про­мы­воч­ный №2 уда­лен пол­но­стью и инку­би­ро­вать про­бирки с откры­тыми крыш­ками в тер­мо­стате при 60°С в тече­ние 4–10 мин». Инку­ба­ция в дан­ном про­то­коле про­во­дится для пол­ного высу­ши­ва­ния оста­точ­ной надо­са­доч­ной жид­ко­сти, т.к. в ней нахо­дятся инги­би­торы ПЦР, однако и пере­су­ши­вать маг­нит­ные частицы не реко­мен­ду­ется. Тогда воз­ни­кает вопрос как мне пра­вильно подо­брать время инку­ба­ции, поста­вить 4  минуты или 10 минут. У раз­лич­ных поль­зо­ва­те­лей в зави­си­мо­сти от инди­ви­ду­аль­ных  осо­бен­но­стей и опыта работы оста­ется раз­лич­ное коли­че­ство оста­точ­ной надо­са­доч­ной жид­ко­сти, поэтому мы реко­мен­дуем пер­во­на­чально поста­вить время инку­ба­ции 4 минуты. Далее извле­каем пару про­би­рок и про­смат­ри­ваем про­бирки есть жид­кость внизу или нет. Если жид­кость отсут­ствует пере­хо­дим к пункту инструк­ции 9.1.16 и вно­сим элю­и­ру­ю­щий буфер. Если жид­кость надо­са­доч­ная не высохла до конца в про­бир­ках, про­дол­жаем далее инку­ба­цию до ее пол­ного высы­ха­ния.  В слу­чае если из про­би­рок в тер­мо­стате изда­ется харак­тер­ное потрес­ки­ва­ние, извле­кайте срочно про­бирки из тер­мо­стата и добав­ляйте элю­и­ру­ю­щий рас­твор, ваши маг­нит­ные частицы с при­креп­лен­ными к ним РНК/ДНК начи­нают пере­сы­хать.

Часто задаваемый вопросы по пункту 9.1.15

Нельзя ни в коем слу­чае повы­шать тем­пе­ра­туру инку­ба­ции, такие дей­ствия при­ве­дут к пере­сы­ха­нию маг­нит­ных  частиц и в конеч­ном счеты вы потра­тите сэко­ном­лен­ное время на раз­би­ва­ние при­сох­шего (спек­ше­гося) осадка.  Время можно сокра­тить при посто­ян­ной про­верке образ­цов на пол­ное высы­ха­ние надо­са­доч­ной жид­ко­сти.

Если образцы будут исполь­зо­ваны для поста­новки ампли­фи­ка­ции сразу после про­ве­де­ния выде­ле­ния ско­рее всего вы полу­чите выход про­дук­тов и про­хож­де­ние внут­рен­него кон­троля на 5  цик­лов позд­нее ожи­да­е­мого резуль­тата. В слу­чае если такие образцы пой­дут на дли­тель­ное  хра­не­ние ско­рее всего РНК в образ­цах во время хра­не­ния раз­ру­шиться и вы не полу­чите ни досто­вер­ных  дан­ных,  ни про­хож­де­ния внут­рен­них  кон­тро­лей.  Пожа­луй­ста, сле­дуйте ука­за­ниям в инструк­ции и тогда вы полу­чите досто­вер­ные дан­ные и не потра­тите  время на повтор­ные про­це­дуры выде­ле­ния и ампли­фи­ка­ции.

Кратковременное центрифугирование

В раз­лич­ных лабо­ра­то­риях уста­нов­лены раз­ные модели цен­три­фуг под крат­ко­вре­мен­ным цен­три­фу­ги­ро­ва­нием пони­ма­ется  разо­вое нажа­тие и удер­жа­ние в тече­ние 3–5 секунд кнопки (Run / Start / Запуск)

biosan msc 3000

В центрифуге Biosan MSC-3000—это разовое нажатие на кнопку Run/​Stop.

Кратковременное встряхивание

В раз­лич­ных лабо­ра­то­риях уста­нов­лены раз­ные модели вор­тек­сов под крат­ко­вре­мен­ным встря­хи­ваем пони­ма­ется  разо­вое нажа­тие и удер­жа­ние в тече­ние 3–5 секунд про­бирки или про­би­рок с образ­цами.

Осадок

При отборе надо­са­доч­ной жид­ко­сти на всех эта­пах про­то­кола не заде­вайте оса­док маг­нит­ных частиц, ста­рай­тесь направ­лять нако­неч­ник доза­тора в про­ти­во­по­лож­ную сто­рону от осадка.

Температура

Реко­мен­дуем рабо­тать со све­жими образ­цами, при невоз­мож­но­сти, хра­нить образцы в замо­ро­жен­ном состо­я­нии при тем­пе­ра­туре не более минус 16 оС.