Правильное следование инструкциям по работе с набором «ALPREP»
рекомендации по работе
- Перед началом протокола выделения нуклеиновых кислот для выявления РНК коронавируса SARS-CoV‑2 рекомендуем все образцы встряхивать на вортексе в течение 5–6 секунд при максимально возможной скорости. Это поможет получить более однородный материал для проведения ПЦР диагностики, предотвратит расслоение образцов. При работе с мокротой рекомендуем использовать транспортную среду с муколитиком или добавлять в образец Муколизин.
- При большом количестве образцов в лаборатории рекомендуется полный объем магнитного сорбента вносить прямо в лизирующий буфер, поставляемый в заводском флаконе от производителя. Закрываем флакон, переворачиваем крышкой вниз и встряхиваем в течение 1 минуты до получения однородного раствора оранжево-коричневого цвета. Приготовленный раствор проверяем на просвет на отсутствие комков неразбитого магнитного сорбента. Данный раствор готов к применению и стабилен при хранении в течение 48 часов при температуре 2–8оС. НЕ РЕКОМЕНДУЕТСЯ вносить по отдельности в каждую пробирку магнитный сорбент, а затем отдельно лизирующий буфер и смешивать компоненты отдельно в каждой пробирке, таким образом вы увеличиваете ошибку дозирования, расходуете больше время на контроль гомогенности полученного раствора, ухудшается степень разбивания магнитных частиц.
- В нашей инструкции имеются указания о том, что после внесения образцов в лизирующий буфер предварительно смешанный с магнитными частицами требуется провести инкубацию в течение 10 минут при 60оС (п. 9.1.7). В случае если у вас емкость твердотельного термостата менее 96 образцов, вы можете оставить образцы с лизирующим буфером и магнитным сорбентом на рабочей поверхности при комнатной температуре и поставить их в блок термостата после того, как первая партия образцов проинкубируется.
- Отнеситесь внимательно к пункту 9.1.15 инструкции, а именно: «Убедиться, что буфер ALPREP промывочный №2 удален полностью и инкубировать пробирки с открытыми крышками в термостате при 60°С в течение 4–10 мин». Инкубация в данном протоколе проводится для полного высушивания остаточной надосадочной жидкости, т.к. в ней находятся ингибиторы ПЦР, однако и пересушивать магнитные частицы не рекомендуется. Тогда возникает вопрос как мне правильно подобрать время инкубации, поставить 4 минуты или 10 минут. У различных пользователей в зависимости от индивидуальных особенностей и опыта работы остается различное количество остаточной надосадочной жидкости, поэтому мы рекомендуем первоначально поставить время инкубации 4 минуты. Далее извлекаем пару пробирок и просматриваем пробирки есть жидкость внизу или нет. Если жидкость отсутствует переходим к пункту инструкции 9.1.16 и вносим элюирующий буфер. Если жидкость надосадочная не высохла до конца в пробирках, продолжаем далее инкубацию до ее полного высыхания. В случае если из пробирок в термостате издается характерное потрескивание, извлекайте срочно пробирки из термостата и добавляйте элюирующий раствор, ваши магнитные частицы с прикрепленными к ним РНК/ДНК начинают пересыхать.
Часто задаваемый вопросы по пункту 9.1.15
Нельзя ни в коем случае повышать температуру инкубации, такие действия приведут к пересыханию магнитных частиц и в конечном счеты вы потратите сэкономленное время на разбивание присохшего (спекшегося) осадка. Время можно сократить при постоянной проверке образцов на полное высыхание надосадочной жидкости.
Если образцы будут использованы для постановки амплификации сразу после проведения выделения скорее всего вы получите выход продуктов и прохождение внутреннего контроля на 5 циклов позднее ожидаемого результата. В случае если такие образцы пойдут на длительное хранение скорее всего РНК в образцах во время хранения разрушиться и вы не получите ни достоверных данных, ни прохождения внутренних контролей. Пожалуйста, следуйте указаниям в инструкции и тогда вы получите достоверные данные и не потратите время на повторные процедуры выделения и амплификации.
Кратковременное центрифугирование
В различных лабораториях установлены разные модели центрифуг под кратковременным центрифугированием понимается разовое нажатие и удержание в течение 3–5 секунд кнопки (Run / Start / Запуск)
В центрифуге Biosan MSC-3000—это разовое нажатие на кнопку Run/Stop.
Кратковременное встряхивание
В различных лабораториях установлены разные модели вортексов под кратковременным встряхиваем понимается разовое нажатие и удержание в течение 3–5 секунд пробирки или пробирок с образцами.
Осадок
При отборе надосадочной жидкости на всех этапах протокола не задевайте осадок магнитных частиц, старайтесь направлять наконечник дозатора в противоположную сторону от осадка.
Температура
Рекомендуем работать со свежими образцами, при невозможности, хранить образцы в замороженном состоянии при температуре не более минус 16 оС.