Наборы для фун­да­мен­таль­ных раз­ра­бо­ток

АНАЛИЗ микроРНК

Мик­роРНК пред­став­ляют собой корот­кие (20–22 нук­лео­тида) моле­кулы рибо­ну­кле­и­но­вой кис­лоты, хими­че­ская струк­тура кото­рых ана­ло­гична хорошо изу­чен­ным моле­ку­лам инфор­ма­ци­он­ной, транс­порт­ной и рибо­со­маль­ной РНК. 

К насто­я­щему вре­мени пред­по­ла­га­ется, что в клет­ках чело­ве­че­ского орга­низма суще­ствует около трех тысяч типов моле­кул мик­роРНК и они регу­ли­руют работу боль­шин­ства генов, коди­ру­ю­щих про­те­ины.

Основ­ной меха­низм работы мик­роРНК – это «бло­када» экс­прес­сии отдель­ных генов. За опи­са­ние этого фено­мена аме­ри­кан­ские иссле­до­ва­тели Andrew Fare и Craig Mello получи-ли Нобе­лев­скую пре­мию по физио­ло­гии и меди­цине в 2006 году. В тече­ние после­дую-щих лет наши пред­став­ле­ния о работе системы регу­ля­ции ген­ной экс­прес­сии с помо­щью моле­кул мир­коРНК суще­ственно углу­би­лись. Пред­по­ла­га­ется, что ком­плекс­ная система вза­и­мо­дей­ствия этих регу­ля­тор­ных моле­кул явля­ется основ­ным меха­низ­мом дина­миче-ской регу­ля­ции белок-сек­ре­ти­ру­ю­щего аппа­рата клетки.

Неопла­сти­че­ская транс­фор­ма­ция свя­зана с изме­не­нием состава и, соот­вет­ственно, иска-жением регу­ля­тор­ной актив­но­сти мик­роРНК-ового аппа­рата. При­чем эта связь может иметь раз­лич­ную при­чинно-след­ствен­ную направ­лен­ность. Было заме­чено, что так назы-вае­мые «хруп­кие» участки (fragile site) генома – места частых пере­строек и мута­ций– ча-сто коди­руют целые семей­ства моле­кул мик­роРНК. Мута­ции в этих реги­о­нах иска­жают состав кле­точ­ных мик­роРНК и при­во­дят к раз­ви­тию раз­лич­ных онко­ло­ги­че­ских заболе-ваний, вклю­чая рак лег­ких, тол­стой кишки и желудка. Это ука­зы­вает на воз­мож­ную этио-логи­че­скую роль мик­роРНК в раз­ви­тии рака. Кроме того, мик­роРНК в нор­маль­ной клет-ке регу­ли­руют мета­бо­лизм, про­ли­фе­ра­тив­ную актив­ность, диф­фе­рен­ци­ровку и физиоло-гиче­скую кле­точ­ную гибель (апо­птоз). Нару­ше­ние этих про­цес­сов в ходе неопла­стиче-ской транс­фор­ма­ции может вызы­вать адап­тив­ные (вто­рич­ные) изме­не­ния про­филя внут-рикле­точ­ных мик­роРНК. Кан­це­ро­ген­ный харак­тер неко­то­рых мик­роРНК под­твер­жден мно­гими иссле­до­ва­ни­ями. Напри­мер, миР-21 – моле­кула мик­роРНК, инги­би­ру­ю­щая про-дук­цию клет­кой ряда тумор-супрес­со­ро­ных бел­ков, участ­вует в раз­ви­тии мно­гих опухо-лей. В совре­мен­ной моле­ку­ляр­ной онко­ло­гии появи­лось поня­тие «онко-миР»—микроРНК с харак­тер­ным кан­це­ро­ген­ным эффек­том, напри­мер миР-155, кла­стер род-ствен­ных моле­кул миР-106b/миР-17–92.

Неопла­сти­че­ская транс­фор­ма­ция кле­ток сопро­вож­да­ется спе­ци­фи­че­скими изме­не­ни­ями про­филя (состава) внут­ри­кле­точ­ных мик­роРНК, что опре­де­ляет его потен­ци­аль­ную диа-гно­сти­че­скую цен­ность. Выде­ле­ние мик­роРНК из биоп­сий­ных образ­цов (све­жих, фикси-рован­ных, окра­шен­ных) и ана­лиз про­филя «мар­кер­ных» моле­кул мик­роРНК явля­ется пер­спек­тив­ным мето­дом диа­гно­стики. Кроме того, осо­бен­но­сти про­филя мик­роРНК могут быть свя­заны с опре­де­лен­ными кли­ни­че­ски зна­чи­мыми харак­те­ри­сти­ками опу­холи (напри­мер, чув­стви­тель­но­сти к опре­де­лен­ной тера­пии), что может быть исполь­зо­вано с целью пер­со­на­ли­за­ции лечеб­ной так­тики.

Наборы реагентов для количественного анализа микроРНК

Современное технологичное решение для фундаментальных исследований и разработки новых методов клинической диагностики!

В основе раз­ра­бо­тан­ной тех­но­ло­гии лежит метод, пред­ло­жен­ный груп­пой иссле­до­ва­те­лей под руко­вод­ством Mikael Kubista в 2017. Для удоб­ства рутин­ной работы, мы моди­фи­ци­ро­вали мето­дику: создали ори­ги­наль­ную струк­туру ОТ-прай­мера, изме­нили тех­но­ло­гию оценки эффек­тив­но­сти ампли­фи­ка­ции в реаль­ном вре­мени и опти­ми­зи­ро­вали усло­вия работы фер­мен­тов. Эти изме­не­ния сде­лали работу системы надеж­ной и повы­сили ее чув­стви­тель­ность. Создан­ная нашими иссле­до­ва­те­лями мето­дика поз­во­ляет про­ве­сти надеж­ную коли­че­ствен­ную оценку выбран­ной моле­кулы мик­роРНК в широ­ком диа­па­зоне кон­цен­тра­ций.

Чувствительность

Моди­фи­ка­ция струк­туры ОТ-прай­мера обес­пе­чила воз­мож­ность исполь­зо­ва­ния зон­дов, мечен­ных флу­о­ро­хро­мом (карбок­си­ф­лу­о­рес­цеин, FAM) и гене­ри­ру­ю­щим флу­о­рес­цент­ный сиг­нал после ком­пле­мен­тар­ного вза­и­мо­дей­ствия с ампли­ко­ном. Эта тех­но­ло­гии оценки эффек­тив­но­сти амли­фи­ка­ции опре­де­ляет высо­кую чув­стви­тель­ность и допол­ни­тель­ную спе­ци­фич­ность ана­лиза.

Надежность

Для удоб­ства работы и уве­рен­но­сти в полу­чен­ных резуль­та­тах, каж­дый набор содер­жит восемь калиб­ра­то­ров, кото­рые пред­став­ляют собой рас­творы син­те­ти­че­ских ана­ло­гов детек­ти­ру­е­мой моле­кулы мик­роРНК раз­лич­ной кон­цен­тра­ции. Исполь­зую калиб­ра­торы каж­дый поль­зо­ва­тель смо­жет про­ве­рить «рабо­то­спо­соб­ность» системы и мето­до­ло­ги­че­скую вос­про­из­во­ди­мость резуль­та­тов ОТ-ПЦР.

Анализ без нормализации

После постро­е­ния калиб­ро­воч­ной кри­вой, кото­рая отра­жает пря­мую зави­си­мость эффек­тив­но­сти ампли­фи­ка­ции (зна­че­ний поро­го­вого цикла, Ct) от кон­цен­тра­ции ана­лита (мик­роРНК), появ­ля­ется воз­мож­ность коли­че­ствен­ной оценки мик­роРНК в образ­цах РНК, выде­лен­ной из био­ло­ги­че­ского мате­ри­ала. Если исполь­зу­ется стан­дар­ти­зо­ван­ный про­то­кол выде­ле­ния РНК и зна­че­ния Ct при ана­лизе био­ло­ги­че­ских образ­цов «укла­ды­ва­ются» в зону линей­ной зави­си­мо­сти, оценка кон­цен­тра­ции иссле­ду­е­мых мик­роРНК может про­во­дится непо­сред­ственно, без исполь­зо­ва­ния про­це­дуры «нор­ма­ли­за­ции» отно­си­тельно услов­ных «нор­ма­ли­за­то­ров» (U6, U18, RNU44, RNU48 и др.)

Концентрация молекул микроРНК от порогового цикла

По оси Y: поро­го­вый цикл, Ct
По оси X: кон­цен­тра­ция моле­кул син­те­ти­че­ской miR-371–3p в реак­ци­он­ной смеси, 10^

Методы анализа

ОТ-ПЦР явля­ется основ­ным мето­дом ана­лиза мик­роРНК в лабо­ра­тор­ной прак­тике в силу своей надеж­но­сти и эко­но­мич­но­сти.

В наборе реа­ли­зо­вана ори­ги­наль­ная тех­но­ло­гия дву­сто­рон­него прай­ми­ро­ва­ния обрат­ной тран­скрип­ции и ПЦР с двумя микро-РНК-спе­ци­фич­ными прай­ме­рами (Androvic et al., 2017), что обес­пе­чи­вает исклю­чи­тель­ную точ­ность ана­лиза.

Опти­ми­за­ция струк­туры ОТ-прай­мера и детек­ция ампли­фи­ка­ции с помо­щью зонда обес­пе­чи­вает надеж­ность резуль­та­тов и более высо­кую чув­стви­тель­ность ана­лиза по срав­не­нию с дру­гими тех­но­ло­ги­ями (Korobkina et al., 2018). Это поз­во­ляет рабо­тать с образ­цами РНК низ­кой кон­цен­тра­ции.

Состав набора

Опти­ми­зи­ро­ван­ные фер­мент­ные смеси оте­че­ствен­ного про­из­вод­ства для ОТ и ПЦР.

Сба­лан­си­ро­ван­ные смеси оли­го­нук­лео­ти­дов для прай­ми­ро­ва­ния реак­ций и детек­ции про­цесса ампли­фи­ка­ции в режиме реаль­ного вре­мени.

Набор из 8 калиб­ра­то­ров—раз­ве­де­ний син­те­ти­че­ского «мимика» для постро­е­ния калиб­ро­воч­ной кри­вой и коли­че­ствен­ного ана­лиза мик­роРНК в био­ло­ги­че­ском мате­ри­але.

Длительность анализа

Дли­тель­ность ана­лиза:
2.5 – 3 часа, вклю­чая ОТ (45’) и ПЦР (60’).

Материал

Тре­бо­ва­ния к мате­ри­алу:
РНК должна быть выде­лена (из кле­ток, тка­ней, био­ло­ги­че­ских жид­ко­стей) с помо­щью мето­дов, исклю­ча­ю­щих «потери» корот­ких моле­кул.

Вне­кле­точ­ные мик­роРНК могут при­сут­ство­вать в составе мно­гих био­ло­ги­че­ских жид­ко­стей, вклю­чая плазму. Поэтому оценка каче­ствен­ных или коли­че­ствен­ных изме­не­ний состава цир­ку­ли­ру­ю­щих мир­коРНК явля­ется одним из пер­спек­тив­ных направ­ле­ний раз­ви­тия метода «жид­кост­ной биоп­сии».

Два этапа анализа микроРНК

Для коли­че­ствен­ного ана­лиза мик­роРНК прин­ци­пи­ально при­ме­нимы те же методы, что тра­ди­ци­онно исполь­зу­ются для ана­лиза инфор­ма­ци­он­ных РНК: тех­но­ло­гия мик­ро­чи­пов, секве­ни­ро­ва­ние, вклю­чая пол­но­ге­ном­ное секве­ни­ро­ва­ние РНК, и метод обрат­ной тран­скрип­ции с после­ду­ю­щей поли­ме­раз­ной цеп­ной реак­цией (ОТ-ПЦР). В насто­я­щее время, метод ОТ-ПЦР явля­ется наи­бо­лее часто исполь­зу­е­мым под­хо­дом в силу его надеж­но­сти и отно­си­тельно низ­кой сто­и­мо­сти.

Несмотря на широ­кое рас­про­стра­не­ние, прак­ти­че­ское исполь­зо­ва­ние метода ОТ-ПЦР явля­ется нетри­ви­аль­ной зада­чей. 

1) Резуль­таты ана­лиза мик­роРНК суще­ственно зави­сят от каче­ства РНК, выде­лен­ной из био­ло­ги­че­ских образ­цов.

2) Резуль­таты ОТ-ПЦР ана­лиза могут иска­жаться нали­чием «незре­лых» форм этих моле­кул. 

3) Длина «зре­лой» моле­кулы мик­роРНК сопо­ста­вима по раз­меру с дли­ной прай­ме­ров, пара кото­рых должна иметь «места посадки» на про­тя­же­нии детек­ти­ру­е­мой моле­кулы для ини­ци­а­ции поли­ме­раз­ной цеп­ной реак­ции. 

Поэтому, перед про­ве­де­нием ана­ли­ти­че­ской ПЦР необ­хо­димо «удли­нить» моле­кулу мик­роРНК. Этот этап син­теза моле­кулы ДНК, кото­рая должна иметь длину как мини­мум 50–60 осно­ва­ний и часть кото­рой ком­пле­мен­тарна детек­ти­ру­е­мой мик­роРНК, пред­став­ля­ется кри­тич­ным аспек­том мето­дики ана­лиза мик­роРНК с помо­щью ОТ-ПЦР.

Обратная транскрипция (ОТ)

Cин­тез ДНК, частично ком­пле­мен­тар­ной и детек­ти­ру­е­мой моле­куле мик­роРНК, или обрат­ная тран­скрип­ция (ОТ) про­во­дится с помо­щью мик­роРНК-спе­ци­фич­ного прай­мера с двумя участ­ками ком­пле­мен­тар­ного вза­и­мо­дей­ствия с моле­ку­лой мик­роРНК. В резуль­тате реак­ции син­те­зи­ру­ется моле­кула дли­ной 65–75 нук­лео­ти­дов.

В 2005 году был пред­ло­жен метод обрат­ной тран­скрип­ции миРНК с помо­щью прай­мера, фор­ми­ру­ю­щего т.н. «петлю» (stem-loop primer). Такой под­ход поз­во­лял в резуль­тате реак­ции обрат­ной тран­скрип­ции полу­чить кДНК дли­ной 50–60 осно­ва­ний, что обес­пе­чи­вало воз­мож­ность исполь­зо­ва­ния такой моле­кулы в каче­стве мат­рицы для после­ду­ю­щей ПЦР. В тече­ние после­ду­ю­щих лет этот метод был опти­ми­зи­ро­ван мно­гими иссле­до­ва­те­лями, и теперь он широко исполь­зу­ется и поз­во­ляет полу­чать досто­вер­ные резуль­таты. Важ­ной осо­бен­но­стью этого под­хода явля­ется моле­ку­ляр­ная спе­ци­фич­ность про­ве­де­ния реак­ции обрат­ной тран­скрип­ции: для каж­дого типа детек­ти­ру­е­мых мик­роРНК син­те­зи­ру­ется и исполь­зу­ется соот­вет­ству­ю­щий ОТ-прай­мер.

Синтез молекулы комплементарной или частично комплементарной ДНК

Позд­нее были пред­ло­жены еще несколько мето­дов син­теза кДНК, основ­ной осо­бен­но­стью кото­рых явля­лось неспе­ци­фи­че­ское «удли­не­ние» всех при­сут­ству­ю­щих в образце моле­кул миРНК. После­ду­ю­щая реак­ция обрат­ной тран­скрип­ции ини­ци­и­ру­ется прай­ме­ром, ком­пле­мен­тар­ным добав­лен­ному участку. Такая реак­ция неспе­ци­фична и, тео­ре­ти­че­ски, поз­во­ляет полу­чить пул раз­лич­ных кДНК, соот­вет­ству­ю­щих набору миРНК в иссле­ду­е­мом образце. Этот под­ход, с одной сто­роны, поз­во­ляет эко­номно исполь­зо­вать био­ло­ги­че­ский мате­риал для ана­лиза боль­шого числа раз­лич­ных моле­кул миРНК. С дру­гой сто­роны, чув­стви­тель­ность этого метода ниже, т.к. реак­ция обрат­ной тран­скрип­ции ини­ци­и­ру­ется с помо­щью уни­вер­саль­ного прай­мера рав­но­ве­ро­ятно для всех моле­кул миРНК, что может затруд­нять детек­цию моле­кул с низ­кой копий­но­стью.

Обратная транскрипция кДНК | Альгимед Техно

Готовые реагенты для обратной транскрипции

ОТ-фермент

Гене­ти­че­ски моди­фи­ци­ро­ван­ная обрат­ная тран­скрип­таза (ревер­таза) вируса лей­ке­мии мышей (M‑MuLV). В резуль­тате моди­фи­ка­ции, фер­мент сохра­нил РНК-зави­си­мую поли­ме­раз­ную актив­ность, но утра­тил харак­тер­ную для дикого типа РНКаз­ную актив­ность. Фер­мент спо­со­бен син­те­зи­ро­вать цепь кДНК, опти­маль­ную актив­ность про­яв­ляет при 42°С.

ОТ-буфер

Содер­жит смесь солей Трис-HCl (pH 8,3), KCl, MgCl2, смесь dNTP, дитио­т­ри­тол. В состав буфера вхо­дит уни­каль­ный мик­роРНК-спе­ци­фич­ный ОТ-прай­мер для полу­че­ния моле­кулы кДНК, частично ком­пле­мен­тар­ной детек­ти­ру­е­мой мик­роРНК и име­ю­щей длину 65–75 нук­лео­ти­дов.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Поли­ме­раз­ная цеп­ная реак­ция про­во­дится с помо­щью двух мик­роРНК-спе­ци­фич­ных прай­ме­ров. Эффек­тив­ность ампли­фи­ка­ции оце­ни­ва­ется в режиме реаль­ного вре­мени (real-time quantitative PCR) с помо­щью зон­дов, мече­ных флу­о­рес­цент­ным кра­си­те­лем (FAM).

Ори­ги­наль­ный метод «удли­не­ния» и обрат­ной тран­скрип­ции был недавно пред­ло­жен груп­пой чеш­ских иссле­до­ва­те­лей. Этот метод пред­по­ла­гает исполь­зо­ва­ние для ОТ отно­си­тельно длин­ного прай­мера, кото­рый фор­ми­рует «петлю» в сере­дине моле­кулы, а два его конца ком­пле­мен­тарно свя­зы­вают концы детек­ти­ру­е­мой миРНК, рас­по­ла­га­ясь «навстречу» друг другу. Реак­ция ОТ ини­ци­и­ру­ется одним из кон­цов (3′-) прай­мера, при этом в про­цессе тран­скрип­ции про­ис­хо­дит дис­со­ци­а­ция вто­рого конца (5′-) и син­тез фраг­мента кДНК, ком­пле­мен­тар­ного пол­но­раз­мер­ной моле­куле миРНК. Таким обра­зом полу­ча­ется моле­кула кДНК доста­точ­ной длины и оба конца этой моле­кулы имеют участки, ком­пле­мен­тар­ные детек­ти­ру­е­мой миРНК, что поз­во­ляет исполь­зо­вать два миРНК-спе­ци­фич­ных прай­мера для ПЦР. Эта тех­но­ло­ги­че­ская осо­бен­ность обес­пе­чи­вает высо­кую спе­ци­фич­ность метода, но чув­стви­тель­ность его огра­ни­чена. Длин­ный ОТ прай­мер, име­ю­щий два миРНК-ком­пле­мен­тар­ных участка, может стать при­чи­ной ложно-пози­тив­ного сиг­нала после мно­го­крат­ных цик­лов ПЦР.

ПЦР реакция, проводимая с наборами ALMIR

Готовые реагенты для полимеразной цепной реакции

ПЦР-фермент

HS-Taq ДНК-поли­ме­раза, смесь солей Трис-HCl (pH 8,6), MgCl, KCl, смесь dNTP, Tween20.

ПЦР-буфер

Содер­жит прай­меры для ПЦР и мик­роРНК спе­ци­фич­ный зонд, в состав кото­рого вхо­дит флу­о­рес­цент­ная метка (FAM) и туши­тель (BHQ1).

Уже существующие системы

Наборы реагентов для ОТ-ПЦР анализа микроРНК
«AL-miR-RT-qPCR/hsa-*****»

Наборы ALMIR доступные для заказа прямо сейчас

Моле­кулаАрти­кул набора
mir-106b-5pAL106b-5p
mir-126–3pAL126-3p
mir-145–5pAL145-5p
mir-196b-5pAL196b-5p
mir-10b-5pAL10b-5p
mir-31–5pAL31-5p
mir-221–3pAL221-3p
mir-200b-3pAL200b-3p
mir-200c-3pAL200c-3p
mir-10a-5pAL10a-5p
mir-195–5pAL195-5p
mir-181b-5pAL181b-5p
mir-191–5pAL191-5p
mir-1246–5pAL1246-5p
mir-375–3pAL375-3p
mir-16–5pAL16-5p
mir-29b-3pAL29b-3p
mir-21–5pAL21-5p
mir-451a-5pAL451a-5p
mir-182–5pAL182-5p
mir-205–5pAL205-5p
mir-30a-5pAL30a-5p
mir-371–3pAL371-3p
mir-371–5pAL371-5p
mir-200a-3pAL371-3p
mir-185–5pAL185-5p

Наборы ALMIR доступные
по запросу

Моле­кулаАрти­кул набора
mir-20a-3pAL20a-3p
mir-34a-3pAL34a-3p
mir-126–5pAL126-5p
mir-145–3pAL145-3р
mir-196b-3pAL196b-3p
mir-31–3pAL31-3p
mir-10b-3pAL10b-3p
mir-221–5pAL221-5p
mir-200c-5pAL200c-5p
mir-10a-3pAL10a-3p
mir-200b-5pAL200b-5p
mir-195–3pAL195-3p
mir-181b-3pAL181b-3p
mir-191–3pAL191-3p
mir-24–3pAL24-3p
mir-24–5pAL24-5p
mir-23a-3pAL23a-3p
mir-23a-5pAL23a-5p
mir-143–3pAL143-3p
mir-143–5pAL143-5p
SnRNA-U6ALSnRNA-U6
SNORD48ALSNORD48
SNORD44ALSNORD44
mir-1246–3pAL1246-3p
mir-375–5pAL375-5p
mir-16–3pAL16-3p
mir-29b-5pAL29b-5p
mir-21–3pAL21-3p
mir-146b-3pAL146b-3p
mir-146b-5pAL146b-5p
mir-182–3pAL182-3p
mir-451a-3pAL451a-3p
mir-205–3pAL205-3p
mir-30a-3pAL30a-3p
mir-200a-5pAL371-5p
mir-93–3pAL93-3p
mir-93–5pAL93-5p
mir-185–3pAL185-3p

Форма
заказа ALMIR