АНАЛИЗ микроРНК
МикроРНК представляют собой короткие (20–22 нуклеотида) молекулы рибонуклеиновой кислоты, химическая структура которых аналогична хорошо изученным молекулам информационной, транспортной и рибосомальной РНК.
К настоящему времени предполагается, что в клетках человеческого организма существует около трех тысяч типов молекул микроРНК и они регулируют работу большинства генов, кодирующих протеины.
Основной механизм работы микроРНК – это «блокада» экспрессии отдельных генов. За описание этого феномена американские исследователи Andrew Fare и Craig Mello получи-ли Нобелевскую премию по физиологии и медицине в 2006 году. В течение последую-щих лет наши представления о работе системы регуляции генной экспрессии с помощью молекул миркоРНК существенно углубились. Предполагается, что комплексная система взаимодействия этих регуляторных молекул является основным механизмом динамиче-ской регуляции белок-секретирующего аппарата клетки.
Неопластическая трансформация связана с изменением состава и, соответственно, иска-жением регуляторной активности микроРНК-ового аппарата. Причем эта связь может иметь различную причинно-следственную направленность. Было замечено, что так назы-ваемые «хрупкие» участки (fragile site) генома – места частых перестроек и мутаций– ча-сто кодируют целые семейства молекул микроРНК. Мутации в этих регионах искажают состав клеточных микроРНК и приводят к развитию различных онкологических заболе-ваний, включая рак легких, толстой кишки и желудка. Это указывает на возможную этио-логическую роль микроРНК в развитии рака. Кроме того, микроРНК в нормальной клет-ке регулируют метаболизм, пролиферативную активность, дифференцировку и физиоло-гическую клеточную гибель (апоптоз). Нарушение этих процессов в ходе неопластиче-ской трансформации может вызывать адаптивные (вторичные) изменения профиля внут-риклеточных микроРНК. Канцерогенный характер некоторых микроРНК подтвержден многими исследованиями. Например, миР-21 – молекула микроРНК, ингибирующая про-дукцию клеткой ряда тумор-супрессороных белков, участвует в развитии многих опухо-лей. В современной молекулярной онкологии появилось понятие «онко-миР»—микроРНК с характерным канцерогенным эффектом, например миР-155, кластер род-ственных молекул миР-106b/миР-17–92.
Неопластическая трансформация клеток сопровождается специфическими изменениями профиля (состава) внутриклеточных микроРНК, что определяет его потенциальную диа-гностическую ценность. Выделение микроРНК из биопсийных образцов (свежих, фикси-рованных, окрашенных) и анализ профиля «маркерных» молекул микроРНК является перспективным методом диагностики. Кроме того, особенности профиля микроРНК могут быть связаны с определенными клинически значимыми характеристиками опухоли (например, чувствительности к определенной терапии), что может быть использовано с целью персонализации лечебной тактики.
Наборы реагентов для количественного анализа микроРНК
Современное технологичное решение для фундаментальных исследований и разработки новых методов клинической диагностики!
В основе разработанной технологии лежит метод, предложенный группой исследователей под руководством Mikael Kubista в 2017. Для удобства рутинной работы, мы модифицировали методику: создали оригинальную структуру ОТ-праймера, изменили технологию оценки эффективности амплификации в реальном времени и оптимизировали условия работы ферментов. Эти изменения сделали работу системы надежной и повысили ее чувствительность. Созданная нашими исследователями методика позволяет провести надежную количественную оценку выбранной молекулы микроРНК в широком диапазоне концентраций.
Чувствительность
Модификация структуры ОТ-праймера обеспечила возможность использования зондов, меченных флуорохромом (карбоксифлуоресцеин, FAM) и генерирующим флуоресцентный сигнал после комплементарного взаимодействия с ампликоном. Эта технологии оценки эффективности амлификации определяет высокую чувствительность и дополнительную специфичность анализа.
Надежность
Для удобства работы и уверенности в полученных результатах, каждый набор содержит восемь калибраторов, которые представляют собой растворы синтетических аналогов детектируемой молекулы микроРНК различной концентрации. Использую калибраторы каждый пользователь сможет проверить «работоспособность» системы и методологическую воспроизводимость результатов ОТ-ПЦР.
Анализ без нормализации
После построения калибровочной кривой, которая отражает прямую зависимость эффективности амплификации (значений порогового цикла, Ct) от концентрации аналита (микроРНК), появляется возможность количественной оценки микроРНК в образцах РНК, выделенной из биологического материала. Если используется стандартизованный протокол выделения РНК и значения Ct при анализе биологических образцов «укладываются» в зону линейной зависимости, оценка концентрации исследуемых микроРНК может проводится непосредственно, без использования процедуры «нормализации» относительно условных «нормализаторов» (U6, U18, RNU44, RNU48 и др.)
По оси Y: пороговый цикл, Ct
По оси X: концентрация молекул синтетической miR-371–3p в реакционной смеси, 10^
Методы анализа
ОТ-ПЦР является основным методом анализа микроРНК в лабораторной практике в силу своей надежности и экономичности.
В наборе реализована оригинальная технология двустороннего праймирования обратной транскрипции и ПЦР с двумя микро-РНК-специфичными праймерами (Androvic et al., 2017), что обеспечивает исключительную точность анализа.
Оптимизация структуры ОТ-праймера и детекция амплификации с помощью зонда обеспечивает надежность результатов и более высокую чувствительность анализа по сравнению с другими технологиями (Korobkina et al., 2018). Это позволяет работать с образцами РНК низкой концентрации.
Состав набора
Оптимизированные ферментные смеси отечественного производства для ОТ и ПЦР.
Сбалансированные смеси олигонуклеотидов для праймирования реакций и детекции процесса амплификации в режиме реального времени.
Набор из 8 калибраторов—разведений синтетического «мимика» для построения калибровочной кривой и количественного анализа микроРНК в биологическом материале.
Длительность анализа
Длительность анализа:
2.5 – 3 часа, включая ОТ (45’) и ПЦР (60’).
Материал
Требования к материалу:
РНК должна быть выделена (из клеток, тканей, биологических жидкостей) с помощью методов, исключающих «потери» коротких молекул.
Внеклеточные микроРНК могут присутствовать в составе многих биологических жидкостей, включая плазму. Поэтому оценка качественных или количественных изменений состава циркулирующих миркоРНК является одним из перспективных направлений развития метода «жидкостной биопсии».
Два этапа анализа микроРНК
Для количественного анализа микроРНК принципиально применимы те же методы, что традиционно используются для анализа информационных РНК: технология микрочипов, секвенирование, включая полногеномное секвенирование РНК, и метод обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР). В настоящее время, метод ОТ-ПЦР является наиболее часто используемым подходом в силу его надежности и относительно низкой стоимости.
Несмотря на широкое распространение, практическое использование метода ОТ-ПЦР является нетривиальной задачей.
1) Результаты анализа микроРНК существенно зависят от качества РНК, выделенной из биологических образцов.
2) Результаты ОТ-ПЦР анализа могут искажаться наличием «незрелых» форм этих молекул.
3) Длина «зрелой» молекулы микроРНК сопоставима по размеру с длиной праймеров, пара которых должна иметь «места посадки» на протяжении детектируемой молекулы для инициации полимеразной цепной реакции.
Поэтому, перед проведением аналитической ПЦР необходимо «удлинить» молекулу микроРНК. Этот этап синтеза молекулы ДНК, которая должна иметь длину как минимум 50–60 оснований и часть которой комплементарна детектируемой микроРНК, представляется критичным аспектом методики анализа микроРНК с помощью ОТ-ПЦР.
Обратная транскрипция (ОТ)
Cинтез ДНК, частично комплементарной и детектируемой молекуле микроРНК, или обратная транскрипция (ОТ) проводится с помощью микроРНК-специфичного праймера с двумя участками комплементарного взаимодействия с молекулой микроРНК. В результате реакции синтезируется молекула длиной 65–75 нуклеотидов.
В 2005 году был предложен метод обратной транскрипции миРНК с помощью праймера, формирующего т.н. «петлю» (stem-loop primer). Такой подход позволял в результате реакции обратной транскрипции получить кДНК длиной 50–60 оснований, что обеспечивало возможность использования такой молекулы в качестве матрицы для последующей ПЦР. В течение последующих лет этот метод был оптимизирован многими исследователями, и теперь он широко используется и позволяет получать достоверные результаты. Важной особенностью этого подхода является молекулярная специфичность проведения реакции обратной транскрипции: для каждого типа детектируемых микроРНК синтезируется и используется соответствующий ОТ-праймер.
Позднее были предложены еще несколько методов синтеза кДНК, основной особенностью которых являлось неспецифическое «удлинение» всех присутствующих в образце молекул миРНК. Последующая реакция обратной транскрипции инициируется праймером, комплементарным добавленному участку. Такая реакция неспецифична и, теоретически, позволяет получить пул различных кДНК, соответствующих набору миРНК в исследуемом образце. Этот подход, с одной стороны, позволяет экономно использовать биологический материал для анализа большого числа различных молекул миРНК. С другой стороны, чувствительность этого метода ниже, т.к. реакция обратной транскрипции инициируется с помощью универсального праймера равновероятно для всех молекул миРНК, что может затруднять детекцию молекул с низкой копийностью.
Готовые реагенты для обратной транскрипции
ОТ-фермент
Генетически модифицированная обратная транскриптаза (ревертаза) вируса лейкемии мышей (M‑MuLV). В результате модификации, фермент сохранил РНК-зависимую полимеразную активность, но утратил характерную для дикого типа РНКазную активность. Фермент способен синтезировать цепь кДНК, оптимальную активность проявляет при 42°С.
ОТ-буфер
Содержит смесь солей Трис-HCl (pH 8,3), KCl, MgCl2, смесь dNTP, дитиотритол. В состав буфера входит уникальный микроРНК-специфичный ОТ-праймер для получения молекулы кДНК, частично комплементарной детектируемой микроРНК и имеющей длину 65–75 нуклеотидов.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Полимеразная цепная реакция проводится с помощью двух микроРНК-специфичных праймеров. Эффективность амплификации оценивается в режиме реального времени (real-time quantitative PCR) с помощью зондов, меченых флуоресцентным красителем (FAM).
Оригинальный метод «удлинения» и обратной транскрипции был недавно предложен группой чешских исследователей. Этот метод предполагает использование для ОТ относительно длинного праймера, который формирует «петлю» в середине молекулы, а два его конца комплементарно связывают концы детектируемой миРНК, располагаясь «навстречу» друг другу. Реакция ОТ инициируется одним из концов (3′-) праймера, при этом в процессе транскрипции происходит диссоциация второго конца (5′-) и синтез фрагмента кДНК, комплементарного полноразмерной молекуле миРНК. Таким образом получается молекула кДНК достаточной длины и оба конца этой молекулы имеют участки, комплементарные детектируемой миРНК, что позволяет использовать два миРНК-специфичных праймера для ПЦР. Эта технологическая особенность обеспечивает высокую специфичность метода, но чувствительность его ограничена. Длинный ОТ праймер, имеющий два миРНК-комплементарных участка, может стать причиной ложно-позитивного сигнала после многократных циклов ПЦР.
Готовые реагенты для полимеразной цепной реакции
ПЦР-фермент
HS-Taq ДНК-полимераза, смесь солей Трис-HCl (pH 8,6), MgCl, KCl, смесь dNTP, Tween20.
ПЦР-буфер
Содержит праймеры для ПЦР и микроРНК специфичный зонд, в состав которого входит флуоресцентная метка (FAM) и тушитель (BHQ1).
Уже существующие системы
Наборы реагентов для ОТ-ПЦР анализа микроРНК
«AL-miR-RT-qPCR/hsa-*****»
Наборы ALMIR доступные для заказа прямо сейчас
| Молекула | Артикул набора |
| mir-106b-5p | AL106b-5p |
| mir-126–3p | AL126-3p |
| mir-145–5p | AL145-5p |
| mir-196b-5p | AL196b-5p |
| mir-10b-5p | AL10b-5p |
| mir-31–5p | AL31-5p |
| mir-221–3p | AL221-3p |
| mir-200b-3p | AL200b-3p |
| mir-200c-3p | AL200c-3p |
| mir-10a-5p | AL10a-5p |
| mir-195–5p | AL195-5p |
| mir-181b-5p | AL181b-5p |
| mir-191–5p | AL191-5p |
| mir-1246–5p | AL1246-5p |
| mir-375–3p | AL375-3p |
| mir-16–5p | AL16-5p |
| mir-29b-3p | AL29b-3p |
| mir-21–5p | AL21-5p |
| mir-451a-5p | AL451a-5p |
| mir-182–5p | AL182-5p |
| mir-205–5p | AL205-5p |
| mir-30a-5p | AL30a-5p |
| mir-371–3p | AL371-3p |
| mir-371–5p | AL371-5p |
| mir-200a-3p | AL371-3p |
| mir-185–5p | AL185-5p |
Наборы ALMIR доступные
по запросу
| Молекула | Артикул набора |
| mir-20a-3p | AL20a-3p |
| mir-34a-3p | AL34a-3p |
| mir-126–5p | AL126-5p |
| mir-145–3p | AL145-3р |
| mir-196b-3p | AL196b-3p |
| mir-31–3p | AL31-3p |
| mir-10b-3p | AL10b-3p |
| mir-221–5p | AL221-5p |
| mir-200c-5p | AL200c-5p |
| mir-10a-3p | AL10a-3p |
| mir-200b-5p | AL200b-5p |
| mir-195–3p | AL195-3p |
| mir-181b-3p | AL181b-3p |
| mir-191–3p | AL191-3p |
| mir-24–3p | AL24-3p |
| mir-24–5p | AL24-5p |
| mir-23a-3p | AL23a-3p |
| mir-23a-5p | AL23a-5p |
| mir-143–3p | AL143-3p |
| mir-143–5p | AL143-5p |
| SnRNA-U6 | ALSnRNA-U6 |
| SNORD48 | ALSNORD48 |
| SNORD44 | ALSNORD44 |
| mir-1246–3p | AL1246-3p |
| mir-375–5p | AL375-5p |
| mir-16–3p | AL16-3p |
| mir-29b-5p | AL29b-5p |
| mir-21–3p | AL21-3p |
| mir-146b-3p | AL146b-3p |
| mir-146b-5p | AL146b-5p |
| mir-182–3p | AL182-3p |
| mir-451a-3p | AL451a-3p |
| mir-205–3p | AL205-3p |
| mir-30a-3p | AL30a-3p |
| mir-200a-5p | AL371-5p |
| mir-93–3p | AL93-3p |
| mir-93–5p | AL93-5p |
| mir-185–3p | AL185-3p |
