АНАЛИЗ микроРНК
ALMIR – наборы для анализа миРНК
Современное технологичное решение для фундаментальных исследований и разработки новых методов клинической диагностики!
МикроРНК (миРНК)
Основной механизм работы микроРНК – это «блокада» экспрессии отдельных генов. За описание этого феномена американские исследователи Andrew Fare и Craig Mello получи-ли Нобелевскую премию по физиологии и медицине в 2006 году. В течение последую-щих лет наши представления о работе системы регуляции генной экспрессии с помощью молекул миркоРНК существенно углубились. Предполагается, что комплексная система взаимодействия этих регуляторных молекул является основным механизмом динамиче-ской регуляции белок-секретирующего аппарата клетки.
Неопластическая трансформация связана с изменением состава и, соответственно, иска-жением регуляторной активности микроРНК-ового аппарата. Причем эта связь может иметь различную причинно-следственную направленность. Было замечено, что так назы-ваемые «хрупкие» участки (fragile site) генома – места частых перестроек и мутаций– ча-сто кодируют целые семейства молекул микроРНК. Мутации в этих регионах искажают состав клеточных микроРНК и приводят к развитию различных онкологических заболе-ваний, включая рак легких, толстой кишки и желудка. Это указывает на возможную этио-логическую роль микроРНК в развитии рака. Кроме того, микроРНК в нормальной клет-ке регулируют метаболизм, пролиферативную активность, дифференцировку и физиоло-гическую клеточную гибель (апоптоз). Нарушение этих процессов в ходе неопластиче-ской трансформации может вызывать адаптивные (вторичные) изменения профиля внут-риклеточных микроРНК. Канцерогенный характер некоторых микроРНК подтвержден многими исследованиями. Например, миР-21 – молекула микроРНК, ингибирующая про-дукцию клеткой ряда тумор-супрессороных белков, участвует в развитии многих опухо-лей. В современной молекулярной онкологии появилось понятие «онко-миР»—микроРНК с характерным канцерогенным эффектом, например миР-155, кластер род-ственных молекул миР-106b/миР-17–92.
Неопластическая трансформация клеток сопровождается специфическими изменениями профиля (состава) внутриклеточных микроРНК, что определяет его потенциальную диа-гностическую ценность. Выделение микроРНК из биопсийных образцов (свежих, фикси-рованных, окрашенных) и анализ профиля «маркерных» молекул микроРНК является перспективным методом диагностики. Кроме того, особенности профиля микроРНК могут быть связаны с определенными клинически значимыми характеристиками опухоли (например, чувствительности к определенной терапии), что может быть использовано с целью персонализации лечебной тактики.
Разработанная технология основана на методе, который был предложен группой исследователей под руководством Микаэля Кубисты в 2017 году. Мы оптимизировали исходный метод чтобы сделать его доступным для рутинного использования. Оригинальная «клешнеобразная» конструкция праймера для обратной транскрипции, оптимизированные смеси ферментов и детекция амплификации на основе миРНК-специфичных флуоресцентных зондов определяют высокую точность и чувствительность аналитической системы.
Высокая специфичность
По сравнению с традиционными методами, технология обратной транскрипции с помощью праймера, структура которого напоминает две «клешни» скорпиона, обеспечивает высокую специфичность связывания молекулы миРНК. Кроме того, в наборах ALMIR детекции амплификации проводится с помощью миРНК-специфичного флуоресцентно меченного зонда. В совокупности эти особенности обеспечивают исключительную специфичность анализа.
Количественный анализ
Системы КОНТРОЛЕЙ ALMIR разработаны для обеспечения возможности количественного анализа микроРНК. В их состав входят синтетические РНК, не имеющие аналогов в клетках Homo Sapience и системы анализа этих молекул. Синтетические РНК в известных концентрациях добавляются в анализируемы образцы РНК перед проведением реакции обратной транскрипции. ПЦР анализ синтетических контролей проводится параллельно с анализом исследуемых миРНК, полученные результаты используются для расчета абсолютных значений концентраций последних.
Контролируемая чувствительность
Любой аналитический метод имеет определенный предел чувствительности. В ходе количественного анализа микроРНК методом ОТ-ПЦР, в ПЦР смеси неизбежно присутствует ОТ-праймер, который имеет участки, комплементарные PCR праймерам. Их взаимодействие может инициировать амплификацию на поздних циклах и стать причиной ложноположительных результатов. Наборы ALMIR предоставляют пользователям возможность проверить, достаточно ли высока чувствительность системы для анализа определенной микроРНК в определенных образцах. Каждый набор содержит восемь калибраторов (набор разведений синтетического аналога микроРНК), которые можно использовать для проверки работоспособности системы. Уверенные результаты анализа биологических образцов должны быть получены в диапазоне линейной зависимости концентрации миРНК и эффективности амплификации (значения пороговых циклов, Ct).
По оси Y: значения пороговых циклов, Ct
По оси X: : концентрация синтетической молекулы miR-371–3p в реакционной смеси для ОТ (20µL), 10^
Технические детали
Внеклеточные микроРНК могут присутствовать в составе многих биологических жидкостей, включая плазму. Поэтому оценка качественных или количественных изменений состава циркулирующих миркоРНК является одним из перспективных направлений развития метода «жидкостной биопсии». Исследования, в которых были использованы наборы ALMIR: «Comparative analysis of RT-qPCR based methodologies for microRNA detection», «Reciprocal Dysregulation of MiR-146b and MiR-451 Contributes in Malignant Phenotype of Follicular Thyroid Tumor».
Метод ОТ-ПЦР
ОТ-ПЦР является основным методом анализа микроРНК в лабораторной практике в силу своей надежности и экономичности.
В наборе реализована оригинальная технология двустороннего праймирования обратной транскрипции и ПЦР с двумя микро-РНК-специфичными праймерами (Androvic et al., 2017), что обеспечивает исключительную точность анализа.
Оптимизация структуры ОТ-праймера и детекция амплификации с помощью зонда обеспечивает надежность результатов и более высокую чувствительность анализа по сравнению с другими технологиями (Korobkina et al., 2018). Это позволяет работать с образцами РНК низкой концентрации.
Задачи и решения
Несмотря на широкое распространение, практическое использование метода ОТ-ПЦР является нетривиальной задачей, так как необходимо учитывать следующие аспекты:
1. Результаты количественного анализа миРНК существенно зависят от качества РНК, выделенной из биологических образцов.
2. Из-за малой длины, зрелая молекула миРНК должна не только подвергается обратной транскрипции, но и удлиняется. Эти модификации необходимы, чтобы сделать возможным следующий этап количественной ПЦР.
3. Количественный ОТ-ПЦР анализ миРНК осложняется наличием структурно сходных молекул и незрелых форм.
Компоненты набора
- Оптимизированные ферментные смеси для ОТ и ПЦР
- Сбалансированные растворы олигонуклеотидов для анализа специфичной молекулы миРНК: ОТ-праймер, пара ПЦР-праймеров и флуоресцентно меченный зонд для детекции амплификации
- Набор из восьми калибраторов – серийные разведения синтетического аналога детектируемой молекулы миРНК
Длительность исследования
Длительность анализа:
2.5 – 3 часа, включая ОТ (45’) и ПЦР (60’).
Два этапа ОТ-ПЦР анализа микроРНК
Обратная транскрипция (ОТ)
Синтез кДНК, или обратная транскрипция (ОТ), проводится с помощью праймера, по флангам которого расположены два сайта комплементарного взаимодействия с детектируемой молекулой микроРНК. При взаимодействии с микроРНК праймер приобретает форму «клешней» скорпиона. Синтез комплементарной ДНК цепи начинается с 3′-конца праймера RT-праймера, по мере продвижения фермента вдоль молекулы миРНК происходит диссоциация 5′- конца ОТ-праймера. В результате синтезируется молекула кДНК длиной 60–70 нуклеотидов, имеющая по флангам два миРНК-специфичных сайта, которые служат местами «посадки» ПЦР праймеров.
Готовые реагенты для обратной транскрипции
ОТ-фермент
Генетически модифицированная обратная транскриптаза (ревертаза) вируса лейкемии мышей (M MuLV). В результате модификации, фермент сохранил РНК-зависимую полимеразную активность, но утратил характерную для дикого типа РНКазную активность. Фермент способен синтезировать цепь кДНК, оптимальную активность проявляет при 42°С.
ОТ-буфер
Содержит смесь солей Трис-HCl (pH 8,3), KCl, MgCl2, смесь dNTP, дитиотритол. В состав буфера входит уникальный микроРНК-специфичный ОТ-праймер для получения молекулы кДНК, частично комплементарной детектируемой микроРНК и имеющей длину 65–75 нуклеотидов.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Полимеразная цепная реакция выполняется с использованием двух микроРНК-специфичных праймеров. Эффективность амплификации оценивается в реальном времени (количественная ПЦР в реальном времени) с использованием микроРНК-специфичных зондов, меченных флуоресцентным красителем и соответствующим гасителем.
Готовые реагенты для полимеразной цепной реакции
ПЦР-фермент
HS-Taq ДНК-полимераза, смесь солей Трис-HCl (pH 8,6), MgCl, KCl, смесь dNTP, Tween20.
ПЦР-буфер
Содержит праймеры для ПЦР и микроРНК специфичный зонд, в состав которого входит флуоресцентная метка (FAM) и тушитель (BHQ1).
Наборы ALMIR доступные для заказа
