Наборы для фун­да­мен­таль­ных разработок

АНАЛИЗ микроРНК

ALMIR – наборы для анализа миРНК

Современное технологичное решение для фундаментальных исследований и разработки новых методов клинической диагностики! 

МикроРНК (миРНК)

Основ­ной меха­низм работы мик­роРНК – это «бло­када» экс­прес­сии отдель­ных генов. За опи­са­ние этого фено­мена аме­ри­кан­ские иссле­до­ва­тели Andrew Fare и Craig Mello получи-ли Нобе­лев­скую пре­мию по физио­ло­гии и меди­цине в 2006 году. В тече­ние после­дую-щих лет наши пред­став­ле­ния о работе системы регу­ля­ции ген­ной экс­прес­сии с помо­щью моле­кул мир­коРНК суще­ственно углу­би­лись. Пред­по­ла­га­ется, что ком­плекс­ная система вза­и­мо­дей­ствия этих регу­ля­тор­ных моле­кул явля­ется основ­ным меха­низ­мом дина­миче-ской регу­ля­ции белок-сек­ре­ти­ру­ю­щего аппа­рата клетки.

Неопла­сти­че­ская транс­фор­ма­ция свя­зана с изме­не­нием состава и, соот­вет­ственно, иска-жением регу­ля­тор­ной актив­но­сти мик­роРНК-ового аппа­рата. При­чем эта связь может иметь раз­лич­ную при­чинно-след­ствен­ную направ­лен­ность. Было заме­чено, что так назы-вае­мые «хруп­кие» участки (fragile site) генома – места частых пере­строек и мута­ций– ча-сто коди­руют целые семей­ства моле­кул мик­роРНК. Мута­ции в этих реги­о­нах иска­жают состав кле­точ­ных мик­роРНК и при­во­дят к раз­ви­тию раз­лич­ных онко­ло­ги­че­ских заболе-ваний, вклю­чая рак лег­ких, тол­стой кишки и желудка. Это ука­зы­вает на воз­мож­ную этио-логи­че­скую роль мик­роРНК в раз­ви­тии рака. Кроме того, мик­роРНК в нор­маль­ной клет-ке регу­ли­руют мета­бо­лизм, про­ли­фе­ра­тив­ную актив­ность, диф­фе­рен­ци­ровку и физиоло-гиче­скую кле­точ­ную гибель (апо­птоз). Нару­ше­ние этих про­цес­сов в ходе неопла­стиче-ской транс­фор­ма­ции может вызы­вать адап­тив­ные (вто­рич­ные) изме­не­ния про­филя внут-рикле­точ­ных мик­роРНК. Кан­це­ро­ген­ный харак­тер неко­то­рых мик­роРНК под­твер­жден мно­гими иссле­до­ва­ни­ями. Напри­мер, миР-21 – моле­кула мик­роРНК, инги­би­ру­ю­щая про-дук­цию клет­кой ряда тумор-супрес­со­ро­ных бел­ков, участ­вует в раз­ви­тии мно­гих опухо-лей. В совре­мен­ной моле­ку­ляр­ной онко­ло­гии появи­лось поня­тие «онко-миР»—микроРНК с харак­тер­ным кан­це­ро­ген­ным эффек­том, напри­мер миР-155, кла­стер род-ствен­ных моле­кул миР-106b/миР-17–92.

Неопла­сти­че­ская транс­фор­ма­ция кле­ток сопро­вож­да­ется спе­ци­фи­че­скими изме­не­ни­ями про­филя (состава) внут­ри­кле­точ­ных мик­роРНК, что опре­де­ляет его потен­ци­аль­ную диа-гно­сти­че­скую цен­ность. Выде­ле­ние мик­роРНК из биоп­сий­ных образ­цов (све­жих, фикси-рован­ных, окра­шен­ных) и ана­лиз про­филя «мар­кер­ных» моле­кул мик­роРНК явля­ется пер­спек­тив­ным мето­дом диа­гно­стики. Кроме того, осо­бен­но­сти про­филя мик­роРНК могут быть свя­заны с опре­де­лен­ными кли­ни­че­ски зна­чи­мыми харак­те­ри­сти­ками опу­холи (напри­мер, чув­стви­тель­но­сти к опре­де­лен­ной тера­пии), что может быть исполь­зо­вано с целью пер­со­на­ли­за­ции лечеб­ной тактики.

Раз­ра­бо­тан­ная тех­но­ло­гия осно­вана на методе, кото­рый был пред­ло­жен груп­пой иссле­до­ва­те­лей под руко­вод­ством Мика­эля Куби­сты в 2017 году. Мы опти­ми­зи­ро­вали исход­ный метод чтобы сде­лать его доступ­ным для рутин­ного исполь­зо­ва­ния. Ори­ги­наль­ная «клеш­не­об­раз­ная» кон­струк­ция прай­мера для обрат­ной тран­скрип­ции, опти­ми­зи­ро­ван­ные смеси фер­мен­тов и детек­ция ампли­фи­ка­ции на основе миРНК-спе­ци­фич­ных флу­о­рес­цент­ных зон­дов опре­де­ляют высо­кую точ­ность и чув­стви­тель­ность ана­ли­ти­че­ской системы.

Высокая специфичность

По срав­не­нию с тра­ди­ци­он­ными мето­дами, тех­но­ло­гия обрат­ной тран­скрип­ции с помо­щью прай­мера, струк­тура кото­рого напо­ми­нает две «клешни» скор­пи­она, обес­пе­чи­вает высо­кую спе­ци­фич­ность свя­зы­ва­ния моле­кулы миРНК. Кроме того, в набо­рах ALMIR детек­ции ампли­фи­ка­ции про­во­дится с помо­щью миРНК-спе­ци­фич­ного флу­о­рес­центно мечен­ного зонда. В сово­куп­но­сти эти осо­бен­но­сти обес­пе­чи­вают исклю­чи­тель­ную спе­ци­фич­ность анализа.

Количественный анализ

Системы КОН­ТРО­ЛЕЙ ALMIR раз­ра­бо­таны для обес­пе­че­ния воз­мож­но­сти коли­че­ствен­ного ана­лиза мик­роРНК. В их состав вхо­дят син­те­ти­че­ские РНК, не име­ю­щие ана­ло­гов в клет­ках Homo Sapience и системы ана­лиза этих моле­кул. Син­те­ти­че­ские РНК в извест­ных кон­цен­тра­циях добав­ля­ются в ана­ли­зи­ру­емы образцы РНК перед про­ве­де­нием реак­ции обрат­ной тран­скрип­ции. ПЦР ана­лиз син­те­ти­че­ских кон­тро­лей про­во­дится парал­лельно с ана­ли­зом иссле­ду­е­мых миРНК, полу­чен­ные резуль­таты исполь­зу­ются для рас­чета абсо­лют­ных зна­че­ний кон­цен­тра­ций последних.

Контролируемая чувствительность

Любой ана­ли­ти­че­ский метод имеет опре­де­лен­ный пре­дел чув­стви­тель­но­сти. В ходе коли­че­ствен­ного ана­лиза мик­роРНК мето­дом ОТ-ПЦР, в ПЦР смеси неиз­бежно при­сут­ствует ОТ-прай­мер, кото­рый имеет участки, ком­пле­мен­тар­ные PCR прай­ме­рам. Их вза­и­мо­дей­ствие может ини­ци­и­ро­вать ампли­фи­ка­цию на позд­них цик­лах и стать при­чи­ной лож­но­по­ло­жи­тель­ных резуль­та­тов. Наборы ALMIR предо­став­ляют поль­зо­ва­те­лям воз­мож­ность про­ве­рить, доста­точно ли высока чув­стви­тель­ность системы для ана­лиза опре­де­лен­ной мик­роРНК в опре­де­лен­ных образ­цах. Каж­дый набор содер­жит восемь калиб­ра­то­ров (набор раз­ве­де­ний син­те­ти­че­ского ана­лога мик­роРНК), кото­рые можно исполь­зо­вать для про­верки рабо­то­спо­соб­но­сти системы. Уве­рен­ные резуль­таты ана­лиза био­ло­ги­че­ских образ­цов должны быть полу­чены в диа­па­зоне линей­ной зави­си­мо­сти кон­цен­тра­ции миРНК и эффек­тив­но­сти ампли­фи­ка­ции (зна­че­ния поро­го­вых цик­лов, Ct).

Концентрация молекул микроРНК от порогового цикла

По оси Y: зна­че­ния поро­го­вых цик­лов, Ct
По оси X: : кон­цен­тра­ция син­те­ти­че­ской моле­кулы miR-371–3p в реак­ци­он­ной смеси для ОТ (20µL), 10^

Технические детали

Вне­кле­точ­ные мик­роРНК могут при­сут­ство­вать в составе мно­гих био­ло­ги­че­ских жид­ко­стей, вклю­чая плазму. Поэтому оценка каче­ствен­ных или коли­че­ствен­ных изме­не­ний состава цир­ку­ли­ру­ю­щих мир­коРНК явля­ется одним из пер­спек­тив­ных направ­ле­ний раз­ви­тия метода «жид­кост­ной биоп­сии». Иссле­до­ва­ния, в кото­рых были исполь­зо­ваны наборы ALMIR: «Comparative analysis of RT-qPCR based methodologies for microRNA detection», «Reciprocal Dysregulation of MiR-146b and MiR-451 Contributes in Malignant Phenotype of Follicular Thyroid Tumor».

Метод ОТ-ПЦР

ОТ-ПЦР явля­ется основ­ным мето­дом ана­лиза мик­роРНК в лабо­ра­тор­ной прак­тике в силу своей надеж­но­сти и экономичности.

В наборе реа­ли­зо­вана ори­ги­наль­ная тех­но­ло­гия дву­сто­рон­него прай­ми­ро­ва­ния обрат­ной тран­скрип­ции и ПЦР с двумя микро-РНК-спе­ци­фич­ными прай­ме­рами (Androvic et al., 2017), что обес­пе­чи­вает исклю­чи­тель­ную точ­ность анализа.

Опти­ми­за­ция струк­туры ОТ-прай­мера и детек­ция ампли­фи­ка­ции с помо­щью зонда обес­пе­чи­вает надеж­ность резуль­та­тов и более высо­кую чув­стви­тель­ность ана­лиза по срав­не­нию с дру­гими тех­но­ло­ги­ями (Korobkina et al., 2018). Это поз­во­ляет рабо­тать с образ­цами РНК низ­кой концентрации.

Задачи и решения

Несмотря на широ­кое рас­про­стра­не­ние, прак­ти­че­ское исполь­зо­ва­ние метода ОТ-ПЦР явля­ется нетри­ви­аль­ной зада­чей, так как необ­хо­димо учи­ты­вать сле­ду­ю­щие аспекты:

1. Резуль­таты коли­че­ствен­ного ана­лиза миРНК суще­ственно зави­сят от каче­ства РНК, выде­лен­ной из био­ло­ги­че­ских образцов.

2. Из-за малой длины, зре­лая моле­кула миРНК должна не только под­вер­га­ется обрат­ной тран­скрип­ции, но и удли­ня­ется. Эти моди­фи­ка­ции необ­хо­димы, чтобы сде­лать воз­мож­ным сле­ду­ю­щий этап коли­че­ствен­ной ПЦР.

3. Коли­че­ствен­ный ОТ-ПЦР ана­лиз миРНК ослож­ня­ется нали­чием струк­турно сход­ных моле­кул и незре­лых форм.

Компоненты набора

  • Опти­ми­зи­ро­ван­ные фер­мент­ные смеси для ОТ и ПЦР
  • Сба­лан­си­ро­ван­ные рас­творы оли­го­нук­лео­ти­дов для ана­лиза спе­ци­фич­ной моле­кулы миРНК: ОТ-прай­мер, пара ПЦР-прай­ме­ров и флу­о­рес­центно мечен­ный зонд для детек­ции амплификации
  • Набор из восьми калиб­ра­то­ров – серий­ные раз­ве­де­ния син­те­ти­че­ского ана­лога детек­ти­ру­е­мой моле­кулы миРНК

Длительность исследования

Дли­тель­ность ана­лиза:
2.5 – 3 часа, вклю­чая ОТ (45’) и ПЦР (60’).

Два этапа ОТ-ПЦР анализа микроРНК

Обратная транскрипция (ОТ)

Син­тез кДНК, или обрат­ная тран­скрип­ция (ОТ), про­во­дится с помо­щью прай­мера, по флан­гам кото­рого рас­по­ло­жены два сайта ком­пле­мен­тар­ного вза­и­мо­дей­ствия с детек­ти­ру­е­мой моле­ку­лой мик­роРНК. При вза­и­мо­дей­ствии с мик­роРНК прай­мер при­об­ре­тает форму «клеш­ней» скор­пи­она. Син­тез ком­пле­мен­тар­ной ДНК цепи начи­на­ется с 3′-конца прай­мера RT-прай­мера, по мере про­дви­же­ния фер­мента вдоль моле­кулы миРНК про­ис­хо­дит дис­со­ци­а­ция 5′- конца ОТ-прай­мера. В резуль­тате син­те­зи­ру­ется моле­кула кДНК дли­ной 60–70 нук­лео­ти­дов, име­ю­щая по флан­гам два миРНК-спе­ци­фич­ных сайта, кото­рые слу­жат местами «посадки» ПЦР праймеров. 

Готовые реагенты для обратной транскрипции

ОТ-фермент

Гене­ти­че­ски моди­фи­ци­ро­ван­ная обрат­ная тран­скрип­таза (ревер­таза) вируса лей­ке­мии мышей (M MuLV). В резуль­тате моди­фи­ка­ции, фер­мент сохра­нил РНК-зави­си­мую поли­ме­раз­ную актив­ность, но утра­тил харак­тер­ную для дикого типа РНКаз­ную актив­ность. Фер­мент спо­со­бен син­те­зи­ро­вать цепь кДНК, опти­маль­ную актив­ность про­яв­ляет при 42°С.

ОТ-буфер

Содер­жит смесь солей Трис-HCl (pH 8,3), KCl, MgCl2, смесь dNTP, дитио­т­ри­тол. В состав буфера вхо­дит уни­каль­ный мик­роРНК-спе­ци­фич­ный ОТ-прай­мер для полу­че­ния моле­кулы кДНК, частично ком­пле­мен­тар­ной детек­ти­ру­е­мой мик­роРНК и име­ю­щей длину 65–75 нуклеотидов.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Поли­ме­раз­ная цеп­ная реак­ция выпол­ня­ется с исполь­зо­ва­нием двух мик­роРНК-спе­ци­фич­ных прай­ме­ров. Эффек­тив­ность ампли­фи­ка­ции оце­ни­ва­ется в реаль­ном вре­мени (коли­че­ствен­ная ПЦР в реаль­ном вре­мени) с исполь­зо­ва­нием мик­роРНК-спе­ци­фич­ных зон­дов, мечен­ных флу­о­рес­цент­ным кра­си­те­лем и соот­вет­ству­ю­щим гасителем.

Готовые реагенты для полимеразной цепной реакции

ПЦР-фермент

HS-Taq ДНК-поли­ме­раза, смесь солей Трис-HCl (pH 8,6), MgCl, KCl, смесь dNTP, Tween20.

ПЦР-буфер

Содер­жит прай­меры для ПЦР и мик­роРНК спе­ци­фич­ный зонд, в состав кото­рого вхо­дит флу­о­рес­цент­ная метка (FAM) и туши­тель (BHQ1).

ПЦР реакция, проводимая с наборами ALMIR
Моле­кула Арти­кул
hsa-miR-106b-5p AL106b-5p
hsa-miR-126–3p AL126-3p
hsa-miR-145–5p AL145-5p
hsa-miR-196b-5p AL196b-5p
hsa-miR-10b-5p AL10b-5p
hsa-miR-31–5p AL31-5p
hsa-miR-221–3p AL221-3p
hsa-miR-200a-3p AL200a-3p
hsa-miR-200b-3p AL200b-3p
hsa-miR-200c-3p AL200c-3p
hsa-miR-10a-5p AL10a-5p
hsa-miR-195–5p AL195-5p
hsa-miR-181b-5p AL181b-5p
hsa-miR-191–5p AL191-5p
hsa-miR-1246–5p AL1246-5p
hsa-miR-375–3p AL375-3p
hsa-miR-16–5p AL16-5p
hsa-miR-29b-3p AL29b-3p
hsa-miR-21–5p AL21-5p
hsa-miR-451a-5p AL451a-5p
hsa-miR-182–5p AL182-5p
hsa-miR-205–5p AL205-5p
hsa-miR-30a-5p AL30a-5p
hsa-miR-371–3p AL371-3p
hsa-miR-371–5p AL371-5p
hsa-miR-185–5p AL185-5p
hsa-miR‑7–5p
hsa-miR-15a-5p
hsa-miR-20a-5p
hsa-miR-23a-3p
hsa-miR-24–3p
hsa-miR-26b-5p
hsa-miR-27a-3p
hsa-miR-34a-5p
hsa-miR-93–5p
hsa-miR-125b-5p
hsa-miR-141–3p
hsa-miR-143–3p
hsa-miR-146b-5p
hsa-miR-155–5p
hsa-miR-186–5p
hsa-miR-302a-3p
hsa-miR-302b-3p
hsa-miR-302c-3p
hsa-miR-302d-3p
hsa-miR-367–3p
hsa-miR-372–3p
hsa-miR-373–3p
hsa-miR-429–3p
hsa-miR-495–3p
hsa-miR-597–5p
hsa-miR-1290–3p
hsa-miR-3688–3p
cel-miR-39–3p
SNORD48
SNORD38B

Форма
заказа ALMIR